Mapowanie genu wywołującego rodzinną gorączkę śródziemnomorską na krótszym ramieniu chromosomu 16 ad

Plazmid p5 HVR (region wysoce zmienny) 18 hybrydyzuje z tablicą o powtarzającej się liczbie kopii, powtórzeniem tandemowym sekwencji o długości 57 pz około 100 kb powyżej kompleksu hemoglobiny a; DNA plazmidowe otrzymano z American Type Culture Collection. Analiza Southern Blot
DNA oczyszczono z linii komórkowych przez trawienie dodecylosiarczanem-proteinazą K, ekstrakcję fenol-chloroform i wytrącanie etanolem. 19 DNA każdego członka rodziny strawiono odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi, poddano elektroforezie i przeniesiono na błony nylonowe. Cały plazmid lub kosmid sondy znakowano fosforem-32 za pomocą losowego starterowania heksadeoksyrybonukleotydem (Oligolabeling Kit, Pharmacia) .21 Hybrydyzacje przeprowadzono w standardowych warunkach w obecności ludzkiego łożyskowego DNA (0,25 mg na mililitr) .22 Przeprowadzono przemywki o wysokiej ostrości z użyciem 0,1 × standardowy cytrynian soli fizjologicznej – 0,1 procentowy dodecylosiarczan sodu w 60 ° C. Autoradiografię wykonano za pomocą folii Kodak XAR-5 przez do 10 dni w temperaturze -70 ° C z ekranami intensyfikującymi.
Analiza sprzężeń
Użyliśmy pakietu LINKAGE (wersja 5.1) programów komputerowych23, aby obliczyć ocenę lod. Punktacja lodowa jest zdefiniowana jako logarytm, do podstawy 10, stosunku szans na korzyść powiązania z szansą przeciwko powiązaniu.24 Ocena lodowa wynosząca 3,0 (co odpowiada ilorazowi szans 1000: 1) lub więcej wynosi za dowód powiązań. Obliczono dwupunktowe lodowe wyniki dla powiązania rodzinnej gorączki śródziemnomorskiej z poszczególnymi markerami DNA. Wielopunktowe wyniki dla lod zostały określone za pomocą programu komputerowego, który obliczył iloraz szans w odniesieniu do więcej niż jednego miejsca znacznika na raz. Wyniki dla Lod zostały obliczone dla różnych możliwych częstotliwości rekombinacji dla genu choroby i loci markera. Częstotliwość rekombinacji jest oznaczona przez .; wartość ., dla której punktacja lod byłaby maksymalna, reprezentowałaby najbardziej prawdopodobną częstotliwość rekombinacji genu dla rodzinnej gorączki śródziemnomorskiej i miejsca lokalizacji markera. W przybliżeniu 95 procent przedziałów ufności dla . uzyskano przez określenie częstotliwości rekombinacji, dla których wynik dla lod był maksymalny minus 1,25 Częstości rekombinacji zostały przekształcone na odległości map zgodnie z formułą Kosambi26; częstotliwość rekombinacji wynosząca procent odpowiada odległości mapy cm.
Obliczenia wykonano na komputerze VAX 8650 w National Cancer Institute Advanced Scientific Computing Laboratory (Frederick, MD) lub na VAXStation 3100 Model 76 w naszym laboratorium. Korzystając z najbardziej aktualnych danych populacyjnych z Sheba Medical Center, skonstruowaliśmy model, w którym rodzinna gorączka śródziemnomorska była uznawana za cechę autosomalnie-recesywną, która miała 95 procentową penetrację u mężczyzn i 70 procentową penetrację u kobiet oraz częstotliwość genu równą 0,045. Mapy odległości i częstotliwości alleli zaczerpnięto z opublikowanych źródeł.27 28 29 30 Dla sondy 5 HVR przyjęto siedem alleli o równej częstotliwości.
Wyniki
Analiza sprzężeń dwupunktowych
Rysunek 1. Rysunek 1. Reprezentatywne autoradiogramy Southern Blot dla dwóch markerów chromosomowych 16p, D16S84 i kompleksu hemoglobiny . (HBA), w dwóch rodzinach z rodzinną gorączką śródziemnomorską
[przypisy: genowefa garage, hydroxyzinum espefa, dzierzęcki ]